タンパク質に基づいた SEC メソッドでのピークテーリングおよび/または分離低下（ピークの広がり）の一般的な原因は何ですか？ - WKB230675

環境

サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)
ピークテーリング
ACQUITY
超高速高分離液体クロマトグラフィー (UPLC)
エチレン架橋型ハイブリッド (BEH)
MaxPeak Premier
カラム

回答

ピークテーリングおよび/または分離低下の一般的な原因には、以下が含まれています（ただし、これらに限定されません）。

微生物の汚染。
- これは、SEC 分離における最も一般的な問題の 1 つです。
  - SEC 分離における微生物汚染の悪影響に関して説明したセクションについては、Guide to Size-Exclusion Chromatography (SEC) of mAb Aggregates, Monomers, and Fragments（『mAb 凝集体、モノマーおよびフラグメントのサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) ガイド』）を参照してください。
サンプル流路内の Teflon (PTFE) の存在。
- Teflon は非常に疎水性であるため、タンパク質が吸着し、テーリングの問題が発生することがあります。
- Teflon フローセルを使用している場合は、ステンレススチール製またはチタン製のフローセルに交換して、この問題を解決します。
システムの拡散（バンド拡散、バンドの広がり）が高すぎます。
- インジェクターと検出器の間のシステム容量が多すぎると、ピークが広がり、テーリングが発生することがあります。
  - 古いフローセルと比較して、容量が大きい新しいフローセル。
  - 古いチューブと比較して、容量が大きい新しいチューブ。
- 流路の接続が不十分な場合、テーリングなどのピーク形状の問題が発生することがあります。
  - フェラルの奥行きが正しくない（短すぎる）と、エンドフィッティング内にボイドが発生することがあります。
  - フェラルが滑りやすくなっています（チューブがエンドフィッティングの中で滑り、空洞が発生することがあります）。
非特異的吸着：
- タンパク質は、ステンレススチールの正電荷へのイオン引力によってステンレススチール製表面に吸着し、テーリングを引き起こすことがあります。
- タンパク質は、疎水性の吸引力によって SEC 粒子に吸着することがあります。
  - 生体分子を数回注入して、ステンレススチール（MaxPeak Premier 以外のハードウェア）と粒子の活性部位を飽和させ、不要な非特異的吸着を防ぎます。ACQUITY UPLC Protein BEH SEC カラムにコンディショニング注入を行う方法が説明されている、ACQUITY UPLC Protein Protein BEH SEC Columns and Standards Care and Use Manual（『ACQUITY UPLC タンパク質 BEH SEC カラムおよび標準試料の維持管理マニュアル』）の 3 ページを参照してください。
- Waters は、ステンレススチールや粒子への非特異的吸着を防止するように設計された ACQUITY Premier Protein SEC 250A および XBridge Premier Protein SEC 250A カラムを提供するようになりました。
カラムヘッドでの粒子の蓄積：
- 微生物の増殖/汚染：
  - ピークテーリングが発生することがありますが、ピーク割れ、分離度の低下、高圧問題がより頻繁に発生します。
    - 低イオン強度の移動相（150 mM 未満）を 2 ～ 3 日ごとに交換します。
    - 高イオン強度の移動相（150 mM を超える）を 2 週間ごとに交換します。
- 添加剤（ポリソルベート 80 など）およびその他のマトリックス成分：
  - 充塡剤に吸着し、分離を低下させることがあります。
疎水性二次相互作用：
- ピークテーリングが発生する可能性があります。
  - 有機共溶媒は通常、疎水性二次相互作用を緩和するために、SEC 移動相で使用されます。有機モディファイヤーを使用する場合、イソプロパノール (IPA) がこれらのカラムの推奨溶媒です。
    - 移動相組成の 5% 以下の濃度から増加し始め、必要に応じてのみ、最大 15% まで増加します。
カラムの冷蔵庫での保管：
- カラム性能の低下につながる可能性があります。
  - ACQUITY UPLC Protein BEH SEC カラム、XBridge Protein BEH SEC カラム、ACQUITY Premier Protein SEC 250A カラム、および XBridge Premier Protein SEC 250A カラムなどの SEC カラムを、冷蔵庫で保管しないことを、Waters は推奨します。
    - これらのカラムは、10% アセトニトリル/90% 25 mM リン酸ナトリウム pH 7.0 + 100 mM KCl を封入して室温で保管してください。
最適ではないカラム保管溶媒：
- これらのカラムは、10% アセトニトリル/90% 25 mM リン酸ナトリウム pH 7.0 + 100 mM KCl 中で、室温で保管することを、Waters は推奨します。
  - 20% メタノール中で保管すると、高分子量分子種または低分子量分子種の分離に悪影響を与える可能性があります。
    - サイズ排除クロマトグラフィーにおいて長期保管時にカラム性能を維持するためのベストプラクティスを参照してください

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