逆相 LC カラムの保持時間が予想よりも小さい一般的な原因は何ですか？ - WKB79531

環境

• 保持時間のシフト
• 保持力の低下
• C18 カラム
• 逆相
• 移動相
• 維持管理

回答

さまざまな要因が考えられます。「追加情報」セクションを参照してください。

追加情報

保持力の低下は、さまざまな要因によって発生します。以下に保持が予想より弱くなる一般的な理由をいくつか示します。

• イオン対試薬によるカラムのコンディショニングが不十分：
  • ヘキサンスルホン酸などのイオン対試薬を使用するメソッドでは、適切な量のイオン対試薬でカラムを飽和させるため、最大でカラム容量の 200 倍のコンディショニングが必要になることがあります。
  • カラムが十分に長くコンディショニングされていない場合、保持はカラムが完全にコンディショニングされるまで弱くなります。
  • PIC Reagents Care＆Use Manual（『PIC 試薬維持管理マニュアル』）を参照してください。
• カラムの再平衡化が不十分（グラジエント分析法の場合）：
  • 各グラジエントテーブルの最後に、C18 カラムのカラム容量の 5 ～ 10 倍で再平衡化することを推奨します。
  • 不適切な再平衡化により、次の注入の前に過剰な有機溶媒がカラムに残ることがあり、これによって最も早く溶出するピークの保持時間が短くなることがあります。
    • 新しいカラムはより多い容量（例えば、カラム容量の 10 倍）での再平衡化が必要であり、古いカラムはより少ない容量（例えば、カラム容量の 5 倍だけ）での再平衡化が必要になります。
      • 古いカラムでは C18 リガンドが失われている可能性があります（下記の「C18 リガンドの加水分解」を参照してください）。
        • これにより、粒子表面の極性がやや高くなり、過剰な有機溶媒はカラムから排出されやすくなります。
        • このため、ポアの疎水性が低いため、より高水系移動相はより簡単にポアに入ることが可能です。
      • 新しいカラムには、より多くの C18 リガンドが含まれています。
        • 粒子表面の疎水性は古いカラムより若干強いです。
        • このため、残留の有機溶媒を除去し、高水系移動相を導入することがより困難になります。
        • このため、新しいカラムは、既存のメソッドであっても、より長い再平衡化が必要になることがあります。
          • 再平衡化をカラム容量の 10 倍に増やすと、予想保持時間の取得に役立つことがあります。
• 100％ 水系移動相での使用を目的として設計されていない C18 カラムのポアのディウェッティング（疎水性崩壊）：
  • 95％ 以上の水を使用する必要のあるメソッドには、送液をオフにしてから送液を再開する場合、保持力の低下が見られます。
  • 保持時間も注入ごとに徐々に減少していくことがあります。
    • 上記のどちらの場合も、ポアの内部は疎水性が非常に強いであるため、水はポアから排出されます。
  • 高水系移動相での使用を目的として設計されていない従来の C18 カラムには、5％ 以上の有機溶媒の使用が推奨されます。
  • Atlantis T3 カラムを用いた 100％ 水性孔のデウェッティング試験を参照してください。
• C18 リガンドの加水分解（リガンドロス）：
  • C18 カラムが古くなると、C18 リガンドは加水分解して粒子から離れるすることがあります。
    • これにより保持が弱くなります。
• カラムヒーターの温度が高すぎる：
  • カラムヒーターが適切に機能していない場合は、予想よりも高温になっている可能性があります。
  • 温度が高いと、分析種が予想より早く溶出することがあります。
  • 外部温度計を使用して、カラムヒーターの実際の温度を測定します。
• 流量が速すぎる：
  • システムチェックバルブまたはポンプが適切に機能していない場合、流量が予想より速くなることがあります。
  • 流量が速いと、分析種が予想より早く溶出します。
  • 分析中の一定時間帯で、メスシリンダーへ廃液を収集します。収集された容量が予想容量であることを確認します。
• チェックバルブの不具合：
  • チェックバルブが汚れると、正常に機能しなくなり、移動相がカラムではなく溶媒ボトルへと流れることがあります。
    • これにより、送液が減少したり、および/または水/有機溶媒の比率が正しくない可能性があります。
• 移動相の混合が不十分 ：
  • カラムに入る前に移動相が十分に混合されていない場合、水:有機溶媒の比率が正しくない可能性があります。
•  グラジエントプロポーショニングバルブが適切に機能しない：
  • グラジエントプロポーショニングバルブ (GPV) によって、送液される有機溶媒が多すぎるか、水系溶媒が少なすぎる可能性があります。
  • どちらの場合も保持力の低下を引き起こす可能性があります。
• 移動相 pH が不適切：
  • 移動相の pH が不適切な場合、イオン性化合物の保持が変化することがあります。
  • 移動相の pH が時間が経つにつれて徐々に変化する場合も、イオン性化合物の保持が変化することがあります。
    • 弱酸では、pH がその pKa より 2 pH 単位以上（または高い）である場合、分析種は帯電し、一般的に極性が高くなります（保持が弱くなります）。
    • 弱塩基では、pH がその pKb より 2 pH 単位以下（または低い）である場合、分析種が帯電し、一般的に極性が高くなります（保持が弱くなります）。
• 移動相組成が正しく調製されていない：
  • 事前に調製した移動相に有機溶媒が多すぎる（または水系が少なすぎる）と、保持が予想よりも弱くなります。
• デュエルボリュームが小さい（グラジエント遅延）：
  • デュエルボリューム（グラジエント遅延）の小さいシステムは、デュエルボリュームの大きいシステム（グラジエント遅延）と比較して、短い保持を示します。
    • デュエルボリューム（グラジエント遅延）と追加のカラム容量（バンドの広がり、システム拡散）：概要およびメソッド移行に与える影響を参照してください