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HDX 逆交換をテストする方法 - WKB97409

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目的または目標

HDX 逆交換をテストする。

プロトンの重陽子逆交換は、HDX で一般的に発生する反応であり、次の複数の原因で発生することがあります:消光溶液およびバッファー中の水と水素の自然な反応、不適切な pH の移動相とバッファー、HDX マネージャおよび ESI ソースで使用される推奨温度より高い温度、注入とサンプル処理の遅延。システムスータビリティ試験の一部として、逆交換は、ホスホリラーゼ b(MassPREP ホスホリラーゼ b 標準試料 - 186002326)のトリプシン消化を分析することで評価できます。

環境

  • SYNAPT G2-S
  • SYNAPT G2-Si
  • SYNAPT XS
  • Xevo G2-S
  • Xevo G2-XS

手順

サンプルは、250 µL の 100% D2O に再溶解し、一晩インキュベーションして、すべてのペプチドが完全に標識されるようにします。

  1. 次に、通常の標識実験(平衡化、消光、システムへの注入(ペプシンカラムなし))を実行した後、ペプチドに残っている標識の割合が評価されます。
  2. そのペプチド中のアミド水素の合計数から重水素化の測定値を差し引いて、逆交換を計算します。対象のタンパク質の逆交換値と比較して、わずかに異なる逆交換値が観察される可能性があります。これは、タンパク質の三次構造とアミノ酸配列や溶出順序の位置の違いによるものです。これにより、システムの逆交換が適切に示されるはずです。最大重水素化は、DynamX の[Relative Uptake](相対取り込み)プロットのスケール y の値で示されています。予想値は 40% 未満であるはずです。

追加情報

レファレンストリプシン消化データ:オンラインのペプチド消化およびトラップパラメーターが 70 µL/分で 3 分間維持されて、予想される逆交換を再現しました。重水素化の暴露時間は 30 分と 2 時間でした。

ペプチド 235 ~ 242 は、相対断片の取り込みの約 70% が保持されます。

Picture01.jpg

ペプチド 248 ~ 255 は、相対断片の取り込みの約 60% が保持されます。

Picture02.jpg

ペプチド 364 ~ 370 は、相対断片の取り込みの約 64% が保持されます。

Picture03.jpg

逆交換が 40% を超えることが発見された場合は、以下を推奨します。

1. 新しい溶媒とバッファーを調製し、校正済みの pH メーターを使用して pH を慎重に調整します。

2. HDX マネージャの温度を確認し、冷却効率が十分に高いことを確認します。高温では逆交換が増加することに注意してください。

3. ソース温度(80 ~ 100 ℃)および脱溶媒温度 (250 ℃) を確認します。

4. MS 設定(特に StepWave に関連する設定)を変更します。

パラメーター 最適化された値
StepWave 1 wave height (V)(StepWave 1 波高 (V)) 30
StepWave 1 Velocity (m/s)(StepWave 1 速度 (m/s)) 300
StepWave 2 Wave height (V)(StepWave 2 波高 (V)) 30
StepWave 2 Velocity (m/s)(StepWave 2 速度 (m/s)) 200
StepWave 2 offset (V)(StepWave 2 オフセット (V)) 15
Diff Aperture 1 offset (V)(差動アパーチャー 1 オフセット (V)) 3
Diff Aperture 2 offset (V)(差動アパーチャー 2 のオフセット (V)) 0
StepWave RF Voltage (V)(StepWave RF 電圧 (V)) 300
Cone gas flow rate (L/h)(コーンガス流量(L/時間)) 90

詳細については、Guttman et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2016, 27, 4, 662–668 を参照してください。

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